实验证明低氧条件下的干细胞培养效果更好！

　　伴随着科研人员对干细胞领域研究的不断深入，诱导性多能干细胞的研究范围也正在迅速扩大。

　　不断发展的iPSC培养技术

　　目前，iPSC正用于药物筛选、人类胚胎学和癌症研究。因此，迫切需要研究产生和培养多能干细胞的有效系统。

　　尽管近期的培养基优化技术取得了一定的进展，使得无异源培养方法有了更多的选择，但是，高效、安全、简便的iPSC培养技术仍处于不断发展之中。

　　除了培养基优化和重编程方法以外，开发稳健培养物的另一个关键因素似乎是细胞产生和发育的环境。

　　诺贝尔奖得主揭示

　　培养物环境的重要性

　　山中伸弥（Shinya Yamanaka）因其在干细胞研究领域取得的成果，与约翰•格登（John Gurdon）一起获得诺贝尔奖。

      他很早就证明缺氧条件（也称为低氧条件）会增强细胞重编程。然而值得注意的是，从那时起，大部分涉及iPSC研究的发表文章却继续使用环境氧气浓度和5%的二氧化碳(CO2)作为常规标准。

　　优化氧气浓度变量至关重要

　　为有效评估新的方法，优化氧气浓度变量十分重要。在本研究中，我们报告了人类包皮成纤维细胞的最佳重编程方案（见图2），该方案包括含有小分子混合物的培养基，培养单附加型（Episomal）载体并进行电穿孔。进行这一研究的目的是确定将低氧条件纳入方案是否可以提高重编程的效率。

　　两种O2浓度实验

　　为实现这一目的，我们选用两种O2浓度进行实验。将O2浓度精确维持在4%，并将在这一条件下得到的重编程结果与标准空气O2浓度条件下得到的结果进行比较。

　　图3：成纤维细胞在电穿孔后24小时内开始表达由pERC-V1编码的基因并通过RFP信号反映。电穿孔后第二天，在低氧条件和常规氧条件下，观察成纤维细胞培养物的RFP荧光，显示明亮表明pERC-V1质粒上携带干细胞标记物。我们估计大约40%的细胞明亮表达RFP。

　　在第10到12天，观察到正常纺锤形成纤维细胞的形态发生变化，在低氧条件下，许多细胞开始变成立方体形状，显示出更紧凑的细胞质。在常规氧条件下，在此时间段内看到的细胞较少。

　　到第15-16天，低氧条件培养物的形态变化非常明显，而在常规氧条件下，这些形态变化才开始变得明显。

　　在低氧条件下，许多集落附着良好，生长稳健，形成具有典型形态的iPSC集落（图6，右图）。

　　而在常规氧条件下，许多集落具有混合细胞类型的形态。经过3次选择性传代后，在常规氧条件下获得了看似稳定的iPSC。经过4次至5次传代后，将两种氧条件下成功重编程的集落接种到24孔板上，进行标准间接免疫染色操作。

　　分散酶处理后重新接种的集落往往比机械分散选取的集落附着情况更好。用Y-27632处理后，集落的存活率更高，在4天内形成集落。传代后7天，观察到许多集落。然而，在低氧条件培养物中观察到的集落形态类似于更纯的成熟iPSC集落。

　　在本研究中，我们通过可调节O2浓度的CO2培养箱提供低氧条件，与常规氧条件相比，电穿孔后12天内，我们始终能够观察到低氧条件下培养的成纤维细胞形态变化，并且在3周后集落明显更好。

　　虽然其他实验室可能使用不同的重编程方法或起始细胞类型，但很明显，本研究提供的数据证明了在重编程期间保持低氧环境的优势。