第二弹｜实验证明低氧条件下的干细胞培养效果更好！

　　自2007年发现体细胞重编程以来，已有数千篇论文研究如何将人类体细胞重编程为多能状态。

　　最初，研究涉及在天然人胚胎干细胞中表达的4个基因：Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc（Lin28和Nanog），使用逆转录病毒等遗传修饰方法递送基因，并在非合成培养基中培养细胞。

　　之后的十几年中，研究人员做出了许多改进，包括：

　　①用不改变基因组的方法取代遗传修饰方法，提高安全性；

　　②用非转化家族成员L-Myc取代c-Myc肿瘤基因；

　　③加入小分子来提高重编程效率；

　　④优化培养条件，如使用低氧浓度条件（4–5%）；

　　⑤使用临床相关且成分明确的培养基和基质。

　　在上一篇推文中，我们通过对比实验证明，低氧浓度相比正常氧气浓度可以提高人类体细胞多能重编程效率。

　　在本次实验中，我们通过许多改进措施，在CellXpert®C170i CO2培养箱中，以低氧条件成功对人包皮成纤维细胞进行重编程，并对单一荧光和可选多顺反子Episomal载体进行改进。

　　在测试的生长培养基中，电穿孔成纤维细胞显示出稳定的细胞粘附和扩增，核型正常的iPSC集落能够在成分明确的培养基中稳定扩增，并能够分化为神经和心脏细胞系。

　　材料与方法

　　基于上一篇所提的人类包皮成纤维细胞重编程方案，我们对质粒pERCv1进行改进，在EBNA-1基因盒上游加入一个PGK启动子（pERCv2，图3）。

　　采用5μg/ml玻连蛋白包被的培养皿，并与合成基质预处理的耗材（Eppendorf FN1 advanced®培养皿）进行对比。

　　一旦诱导性多能干细胞（iPSC）集落出现在重编程培养基中，将其转移至无动物源性低蛋白Protein hESC培养基中进行扩增。

　　所有iPSC扩增和神经元分化早期步骤均在6孔板上进行，而免疫染色分析的细胞或最终分化为运动神经元或心肌细胞的细胞则通过离心接种到24孔培养板上。

　　成纤维细胞重编程

　　将成纤维细胞进行电穿孔，并接种到涂有合成（0.75×106个细胞，A/B）或生物基质（1×106个细胞，C/D）的6孔板上，24小时后观察涂布于合成和生物基质上的成纤维细胞培养物的红色荧光。

　　尽管合成基质上的细胞数量较少（0.75×106 VS 1×106），但细胞的存活率和扩增能力明显增强。因此，在许多玻连蛋白平板培养物中未能观察到重编程细胞。最早能够在涂布后11天观察到重编程发生。

　　在电穿孔和慢病毒转导培养中，两种处理的细胞以相似的方式培养。均匀分布的梭形成纤维细胞呈立方形，并形成未发育的集落。

　　11天后，在两种类型的重编程处理中仅观察到少量RFP，表明可能存在质粒丢失（附加体）或表观遗传失活（慢病毒载体）。

　　虽然RFP信号在两种处理下均显著下调（B/D），但从小集落的出现（A/C）来看，这4个基因至少在第11天达到了成功重编程的阈值。这些小集落在3周内形成了成熟集落。

　　低氧条件下iPSC的扩增和表征

　　图5所示的不成熟集落在涂布后第21天至第30天产生了更多的成熟集落，并使用温和的非酶法进行传代。

　　常规传代3次后，观察到在合成基质（A/B与C/D）上培养的集落比玻连蛋白上培养的集落纯度更高，非重编程成纤维细胞更少。

　　为了纯化玻连蛋白培养细胞，进行人工挑选集落，而在合成基质上生长的iPSC数量超过了在非酶传代过程中脱落的少量成纤维细胞。

　　传代7次后，对合成基质Episomal质粒重编程细胞系进行核型分析，结果正常。

　　将相似的培养物通过离心接种到24孔板上，进行常规多能性或分化标志物分析。

　　在第8代，培养物无明显SSEA1（分化标志物）表达，并稳定表达SSEA4表面标志物和Oct4转录因子。同样，这些细胞共表达了Lin28细胞质RNA结合蛋白、Nanog转录因子和Tra-1-60细胞表面标志物。

　　iPSC向神经元和心肌细胞系分化

　　使用已发布的标准方案，首先将细胞分化为神经上皮细胞，然后再分化为神经干细胞。在神经干细胞培养基中传代4次后，细胞分化形成均匀垫状物（9A），有重复玫瑰花结图案（9C），这是神经干细胞分化阶段的特征。其中许多细胞是OTX2+，更多细胞同时表达Pax6和Nestin。

　　继续将干细胞分化为假定的运动神经元前体。根据分化方案改变小分子和生长因子（图10，上部），部分细胞继续表达OTX2和Nestin，而许多细胞开始表达运动神经元细胞系标志物Olig2。

　　以此条件培养1周后，加入细胞因子和小分子，诱导细胞最终分化为假定的运动神经元（图10，下部）。在最终培养基混合物中培养7天后，细胞形成细小的突起网络（大部分为神经微丝H+，部分保留TUJ1+外观，少部分为GFAP+胶质细胞）。许多表达TUJ1的细胞也表达运动神经元典型标志物，如HB9和Islet-1（数据未显示）。

　　结果清楚表明，低氧培养可用于分化形成神经外胚层细胞系。

　　此外，我们先使用Wnt途径激活剂CHIR99021通过优化的两步程序将细胞分化为定形内胚层，然后使用wntC-59抑制Wnt，将其分化成心肌细胞。

　　培养10–11天后，虽然许多细胞因缺乏胰岛素而死亡，但存活的细胞形成了小斑块和团块。这些“节点”呈三维结构，表达肌钙蛋白T、Nkx2.5和平滑肌动蛋白（SMA）。

　　此外，我们还观察到了肌钙蛋白T以及GATA4和MHCv的稳定表达。所有这些表明心肌细胞系可在低氧环境中发育。

　　综上，我们在CellXpert®C170i CO2培养箱中以低氧浓度（5%）条件成功实现人包皮成纤维细胞重编程。

　　PM1eP5-ERCv2 iPSC细胞系核型正常，表达多能性标志物Oct4+/SSEA4+（但不表达SSEA1−）和Nanog+/Lin28+/Tra-1-60+。

　　此外，在低氧环境下，iPS细胞可分化为不同外胚层细胞、神经元干细胞、运动神经元前体，最终分化为运动神经元。通过使用标准方案，在培养箱内以低氧环境可将iPSC细胞系分化为由内胚层产生的心肌细胞。