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PCR分类(相关信息)

PCR:即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),利用DNA 在体外95°C时解旋(

)55°C时引物与单链按碱基互补配对的原则结合(退火),再调温度至72°C左右, DNA

聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链(延伸)

PCR仪实际就是一个温控设备,能在95'C, 55°C, 72°C之间很好地进行温度控制。根

DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为:普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR

仪,实时荧光定量PCR仪等几类。

普通PCR:

-般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,称之为普通PCR仪,也就是传统的PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。

普通PCR仪主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。

梯度PCR:

PCR反应能否成功,退火温度是关键,梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置,根据结果,-步就可以摸索出最适反应条件。-次性PCR扩增可以设置-系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)的称之为梯度PCR仪。

不同的DNA片段其最适合的退火温度不同,通过设置-系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。

梯度PCR仪主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样既节约时间,也节约成本。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。

梯度PCR仪多应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域以聚合酶链式反应( Picymerase Chain ReactionPCR为特征的、以检测DNA/RNA为目的的各种病原体检测及基因分析。

原位PCR

PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应,而原位PCR是保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增。

不但可以检测到靶DNA,而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中,更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。

原位PCR仪主要应用于:(1)检测外源性基因片段,提高检出率,集中在病毒感染的检查上,如HIVHPVHBVCMV等;(2)观察病原体在体内分布规律;(3)内源性基因片段,如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、IgmRNA片段、癌基因片段等;(4)检测导入基因;(5)遗传病基因检测如β-地中海贫血。 

实时荧光定量PCR:

在普通PCR仪设计基础.上增加荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,形成了具有荧光定量功能的PCR仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同,在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统,得出量化的实时结果输出。

荧光定量PCR仪有单通道,双通道和多通道之分。当只用-种荧光探针标记的时候,选用单通道;有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,实现一次检测多种目的基因的功能。

荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。荧光定量检测技术在临床诊断方面很多,主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断,如肝炎类疾病、性病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等。

 

通道: channel指的是针对每一种荧光的检测器,比如你在-一个管中做多个颜色,针对多个靶基因。每个颜色需要-个检测器来检测荧光信号的强弱,每一个针对不同颜色的检测器,就是一个通道。在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时,为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料,ROX是作为内参的,即参照和校正实验结果。在ABI的机器里显示为红色的水平线。如果你的扩增线在刚开始的时候就高于ROX证明有基因组DNA污染。)或专用的Referencedye,这些荧光染料都必须单独使用-个检测通道。这样以来,真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自己厂家的专用的荧光染料或试剂开放的,有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。

 

选择单通道实验还是多通道实验

这是要根据实验需要来选择的,如果有一个、两个或是三个基因要进行比较,并用看家基因进行对照,可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多,一是条件的优化比较麻烦, 即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行,并且效率都要比较,高,另一个困难是要求相互之间没有干扰,因为干扰会影响到实验结果。还有一一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时,因为共用核音酸等资源的原因,会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些,即一个基因进行多样本比较,用看家基因进行对照。

硬件设计:传统的96孔板的荧光定量PCR可以容纳的样本量大,而且无需特殊的耗材。有些传统的96孔板的仪器采用卤钨灯激发、CCD检测,这些光学结构在96孔板的顶部,每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同一-边缘效应,对结果产生影响。为了保证精确、准确的实验结果,这类仪器在实验过程中通常会使用ROX (-种荧光染料)或专用的Reference dye作为参照校正实验结果。卤钨灯的使用寿命短、更换成本较高已经成为很多用户头痛的问题。在实验过程中卤钨灯作为一种热光源,产生较多热能对实验结果有一定的影响。CCD最大的优点就是可以同时扫描所有样品中的荧光信号,但是灵敏度较低,而且同时检测样品间的荧光信号存在干扰。像ABIBio-rad 公司生产的荧光定量PCR就属于这一种。

 

创新的离心式的仪器通常选用LED激发、PMT检测,离心式的设计上避免了边缘效应。LED光源是冷光源对实验没有影响,因此无需采用其他荧光染料校正仪器,而且使用寿命长无需经常更换。PMT每次只能收集.单个荧光信号,但是检测灵敏度高。但这类仪器运行速度非常快,但也存在样本量小、耗材昂贵、没有梯度功能、存在时间积分等缺点。Corbett Rotor-gene系列和RocheLightcycler 系列均为这一.类仪器。

在荧光定量PCR仪的众多技术参数中,升降温速度也是厂家喜欢大力宣传的指标。更快的升降温,可以缩短反应进行的时间,而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间,提高PCR的特异性。

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