小罗开讲 dPCR在AAV基因治疗产品检测中的应用
大家好，在前几堂课内容里面小罗和大家一起了解了关于dPCR的众多信息。今天，小罗将带大家了解dPCR在AAV基因治疗产品检测中的应用。
生物制药迎来了基因细胞治疗高速发展的时代，基因治疗产品的原理如图1所示【1】，其中AAV病毒载体因具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中【2】。
生物制药迎来了基因细胞治疗高速发展的时代，基因治疗产品的原理如图1所示【1】，其中AAV病毒载体因具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中【2】。
图1. 基因治疗原理
图片来源：罗氏诊断整理
重组AAV病毒载体基因组结构见下图2，该载体在大规模开发和生产的过程中面临的最大挑战，是来自生产工艺上下游优化和检测方法的标准化。同时《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中明确指出：在保证产品疗效的同时能有效控制产品免疫原性风险，病毒载体类产品的规格或剂量建议以相应体积的病毒总颗粒数或基因拷贝数表示。目前病毒载体类产品的基因组滴度也是确定临床给药剂量的重要参考，因此基因治疗产品无论是从工艺开发，还是药学研究，抑或是临床试验的过程都需要建立准确的分析方法来检测病毒载体类产品的基因组滴度。
图2. 腺相关病毒（AAV）基因重组
图片来源：罗氏诊断整理
病毒载体基因组滴度检测的是含目标基因组的病毒浓度，目前常用的检测方法是实时荧光定量PCR（Q-PCR）法【3】。Q-PCR法是基于标准曲线的相对定量的方法，它具有操作简单，快速及成本低的优点，但是目前也面临巨大的挑战，主要表现在Q-PCR检测的结果易受多种因素的干扰【4】，一是Q-PCR的定量依赖标准品；二是标准品与实际样本基因组序列及结构存在差异（如图3和图4）；三是标准品浓度标定的准确性，标准品的稳定性，标准曲线存在批间差异；四是样品中复杂化学试剂残留，这些因素都会对病毒基因组滴度检测结果的准确性造成影响。
相比Q-PCR，数字PCR（dPCR）作为第三代PCR检测技术，在核酸分子浓度检测的灵敏度和准确性都有明显的优势【5】【6】。实践证明dPCR在AAV病毒载体检测方面具有更高的准确性和稳定性【7】。
相比Q-PCR，数字PCR（dPCR）作为第三代PCR检测技术，在核酸分子浓度检测的灵敏度和准确性都有明显的优势【5】【6】。实践证明dPCR在AAV病毒载体检测方面具有更高的准确性和稳定性【7】。
图3. 使用不同结构标准品获得的ITR qPCR（上图）
和SV 40 qPCR（下图）的标准曲线
图片来源：罗氏诊断整理
图4. ITR 不同二级结构的ITR标准版以及
环状质粒DNA的标准品对扩增效率的影响
图片来源：罗氏诊断整理
环状质粒DNA的标准品对扩增效率的影响
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在dPCR检测过程中，整个反应体系被分成多个微反应，进行独立扩增，有些微反应含有目标分子，而有些则不含，通过检测每个微反应的荧光信号强度来判断是否含有目标分子，结合泊松分布统计原理可以直接计算出原有体系中目标分子的浓度【8】。dPCR可直接定量目标核酸分子，不依赖标准品，避免了由标准品引入的定量误差。所以dPCR应用在AAV病毒基因组滴度检测的过程中，可以避免由于标准品二级结构差异对结果准确性和稳定性的影响【7】；同时dPCR检测法也可省去在Q-PCR检测过程中需要对标准曲线做反复的条件摸索和优化。
dPCR检测过程不再是实时荧光监测，而是终点荧光检测，定量结果不依赖扩增效率，对样品中残留物的耐受性更好【8】。这在AAV病毒载体生成过程中的基因组滴度检测尤为重要，生产工艺条件的优化，不同环节的滴度监测中，实际的样品组分多样复杂，但都需要对载体进行准确的定量，Q-PCR方法由于实际样品与标准品在样品组分上存在明显的差异，其定量的载体基因组滴度在准确性和稳定性方面很难满足生产需求，而dPCR检测方法具有明显的优势【7】。就目前市场上dPCR平台按分区方式来分，大致可以分为油包水和物理分区两种，在对样品中残留物的耐受性方面物理分区的方式更有优势【9】。在生产工艺环节的病毒载体滴度的测定中物理芯片式dPCR更适合。
与Q-PCR相比，dPCR对核酸分子拷贝数检测结果的准确性更高，有更低的CV值【10】【11】，如图5所示，分区数量越多准确度越高。基因治疗研究阶段需要跟踪体内载体浓度的变化，稳定准确的滴度才能保证准确的给药剂量，更好的指导临床用药。就临床样本持续定量跟踪检测中，dPCR结果的准确度与Q-PCR方法相比明显更优，尤其是低浓度样本，dPCR有较高的优势【12】。
dPCR检测过程不再是实时荧光监测，而是终点荧光检测，定量结果不依赖扩增效率，对样品中残留物的耐受性更好【8】。这在AAV病毒载体生成过程中的基因组滴度检测尤为重要，生产工艺条件的优化，不同环节的滴度监测中，实际的样品组分多样复杂，但都需要对载体进行准确的定量，Q-PCR方法由于实际样品与标准品在样品组分上存在明显的差异，其定量的载体基因组滴度在准确性和稳定性方面很难满足生产需求，而dPCR检测方法具有明显的优势【7】。就目前市场上dPCR平台按分区方式来分，大致可以分为油包水和物理分区两种，在对样品中残留物的耐受性方面物理分区的方式更有优势【9】。在生产工艺环节的病毒载体滴度的测定中物理芯片式dPCR更适合。
与Q-PCR相比，dPCR对核酸分子拷贝数检测结果的准确性更高，有更低的CV值【10】【11】，如图5所示，分区数量越多准确度越高。基因治疗研究阶段需要跟踪体内载体浓度的变化，稳定准确的滴度才能保证准确的给药剂量，更好的指导临床用药。就临床样本持续定量跟踪检测中，dPCR结果的准确度与Q-PCR方法相比明显更优，尤其是低浓度样本，dPCR有较高的优势【12】。
图5. dPCR实验最佳浓度范围
图片来源：罗氏诊断整理
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dPCR多通道的同时检测比Q-PCR更容易实现，所以在细胞基因治疗领域的应用并不局限于载体滴度检测，如对病毒载体基因结构的完整性，复制型病毒筛查，宿主DNA残留等应用领域也有着巨大的潜力【4】，也是很多企业和平台方法开发的重点方向。
准确快速地定量和表征AAV基因治疗药物是工艺开发和临床申报至关重要的环节，dPCR具备的无需标准品实现绝对定量、多通道同时检测实现多维度的表征，结果重复性和灵敏度较Q-PCR具有绝对优势，已经改变了基因治疗产品的定量和表征标准，成为了行业内必备的检测平台。
准确快速地定量和表征AAV基因治疗药物是工艺开发和临床申报至关重要的环节，dPCR具备的无需标准品实现绝对定量、多通道同时检测实现多维度的表征，结果重复性和灵敏度较Q-PCR具有绝对优势，已经改变了基因治疗产品的定量和表征标准，成为了行业内必备的检测平台。
参考文献：
1. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology volume 38, pages845–855 (2020).
2. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery volume 18, pages358–378 (2019)
3. Practical utilization of recombinant AAV vector reference standards: Focus on vector genomes titration by free ITR qPCR. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development 5(C):16019.
4. PCR-Based Analytical Methods for Quantification and Quality Control of Recombinant Adeno-Associated Viral Vector Preparations. Pharmaceuticals 2022, 15, 23.
5. Principles of digital PCR and its applications in current obstetrical and gynecological diseases. Am J Transl Res. 2019; 11(12): 7209–7222.
6. Considerations for Digital PCR as an Accurate Molecular Diagnostic Tool. Clinical Chemistry 61:1 (2015).
7. Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors. Frontiers in Microbiology July 2019. Volume 10. Article 1570.
8. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. Clinical Chemistry 66:8 (2020)
9. Droplet volume variability as a critical factor for accuracy of absolute quantification using droplet digital PCR. Anal Bioanal Chem (2017) 409:6689–6697.
10. Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR. SLAS Technology 2017, Vol. 22(4) 369–386.
11. Digital PCR Modeling for Maximal Sensitivity, Dynamic Range and Measurement Precision. PLOS ONE March 25, 2015
12. Detection and Quantification of Chimeric Antigen Receptor Transgene Copy Number by Digital PCR versus Real-Time PCR. The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 22, No. 5, May 2020.
1. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology volume 38, pages845–855 (2020).
2. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery volume 18, pages358–378 (2019)
3. Practical utilization of recombinant AAV vector reference standards: Focus on vector genomes titration by free ITR qPCR. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development 5(C):16019.
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5. Principles of digital PCR and its applications in current obstetrical and gynecological diseases. Am J Transl Res. 2019; 11(12): 7209–7222.
6. Considerations for Digital PCR as an Accurate Molecular Diagnostic Tool. Clinical Chemistry 61:1 (2015).
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8. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. Clinical Chemistry 66:8 (2020)
9. Droplet volume variability as a critical factor for accuracy of absolute quantification using droplet digital PCR. Anal Bioanal Chem (2017) 409:6689–6697.
10. Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR. SLAS Technology 2017, Vol. 22(4) 369–386.
11. Digital PCR Modeling for Maximal Sensitivity, Dynamic Range and Measurement Precision. PLOS ONE March 25, 2015
12. Detection and Quantification of Chimeric Antigen Receptor Transgene Copy Number by Digital PCR versus Real-Time PCR. The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 22, No. 5, May 2020.
END
